用微生物电极测定生物化学耗氧量（BODs）的测量标准

1．  适用范围：

本标准是利用固定化微生物膜与氧电极制成微生物电极，以此测量仪器（以下称测量仪）测定发酵废液，下水等的排水中的生物化学耗氧量（以下称BODs）的方法。

备注：本标准所引用的标准见附表1。

2．名词解释：

    本标准所使用的名词定义，除JIS K 0211, JIS K 3600及JIS Z 8103中使用的名词以外，还有以下名词。

（1）       固定化微生物膜：将丝胞酵母在保持其生理机能的状态下封入膜中，我们称其为固定化微生物膜。

（2）       氧电极：指在JIS K 0803中7.3（1）（电极）中规定的测量溶解氧用的电极。

（3）       微生物电极：微生物电极是由固定化微生物膜与可检测微生物在降解有机物时引起的物质浓度变化的电极组成。例如随着微生物呼吸性增加，会伴随着出现氧浓度减少的现象。

3．微生物电极的构成及测定方式：

3．1 固定化微生物膜：使用形式是将固定化微生物膜覆在氧电极表面。

3．2氧电极：可使用以下形式的氧电极。

（1）       隔膜形极谱式氧电极。

（2）       隔膜形原电池式氧电极。

3．3BODs值的测定方法：BODs值的测定方法可采用以下方法进行。

（1）       分批方式

（2）       连续方式

3．4BODs值的计算方式：BODs值的计算方式可采用以下的计算方式。

（1）       根据电极电流的*大变化量进行计算。

（2）       根据电极电流的一定时间后的变化量进行计算。

4．额定电压及额定频率：测量仪使用的额定电压为单相交流100V，额定频率为50Hz，60Hz或50/60Hz共用型。

5．性能：测量仪必须满足以下的性能。

（1）       重现性：使用7.3（1）的试验方法进行试验时，偏差要保待在平均值的±10%。

（2）       响应时间：使用7.3（2）的试验方法进行试验时，响应时间必须在20分钟以内。

（3）       电压变动时的稳定性：使用7.3（3）的试验方法进行试验时，指示值的变动必须在±3%

（4）       阻抗：使用7.3（4）的试验方法进行试验时，阻抗值必须在5MΩ以上。

（5）       耐电压性：使用7.3（5）的试验方法进行试验时，必须保证不发生异常。

6．构造：

6．1基本构造：仪器的构造必须适合以下各项条件。

（1）       形状标准，组装及各部件的加工良好，并且坚固。

（2）       在通常的运转状态下必须保证安全，不能发生任何危险，而且动作稳定、自然。

（3）       各部分必须保证不易发生机械、电气的故障、不会发生危险。

（4）       测量仪的构造必须保证不能因漏水、溅水、结露等因素造成动作不良。

（5）       其构造必须保证在保养、检查时操作简单而且无任何危险。

6．2构成：测量仪如图1所示，由检出部缓冲液等供给部、排出部及指示记录部分所构成。

6．3检出部分：本部分因必须保证微生物电极与被测液保持接触状态，并且保证将产生的信号稳定地输送给指示器，所以由微生物电极、测量池等构成。

（1）       微生物电极：因微生物电极是由固定化微生物膜所构成的，所以是便于更换固定化微生物膜的构造。

（2）       测量池：因必须保证微生物电极与被测试液保持接触状态，其构造既要保证被测试液的适当温度，又能保持氧的浓度，并且不能影响被测试液的流动性。

6．4缓冲溶液等的供给部分：本部分是指能够将缓冲液等送液至检出部的部分。

6．5排出部分：排出部分是指可将检出部分测定后的溶液排出，并能加以保存的部分。

6．6指示记录部分：指示记录部分是指以微生物电极的电流值产生变化的原理为基础，对BODs值或其相当值及指数进行数据显示并打印记录的部分。

6．7附属装置：附属装置是指以下的有必要的附加装置。

（1）       被测试液的供给装置：其功能首先要能将事先准备好的几种被测试液按照顺序送至检出部进行测定。另外*好有能将7.1（5）的BODs校正液随时送出微生物电极进行其校正的功能。

（2）       输出电流记录仪：采用可记录微生物电极的输出电流的记录仪。

7．试验：

7．1试剂：试验时使用的试剂如下所示。

（1）       水：JIS K 0050规定的分析用水。

（2）       葡萄糖：JIS K 8824规定的标准。

（3）       L—谷氨酸： JIS K 9097规定的标准。

（4）       BODs校正原液（GGA）：取葡萄糖150mg和L—谷氨酸150mg用水溶解，然后倒入1000ml的容量瓶中，加水稀释至刻度。配制后要根据JIS K 0102 21.（生物化学耗氧量（BOD））规定的生物化学耗氧量（BOD）的测定方法，确认本校正原液的BOD值为220±10mg/L。此校正原液在配制后应尽快使用。

（5）       BODs校正液：按说明书中记载的BOD值，准确地取校正原液放入容量瓶中稀释至刻度。另外，还可使用按照此标准配制的由*厂家制成的成品BODs校正液。

（6）       缓冲液：使用说明书中记载的液体。

7．2试验条件：试验条件按照以下所述进行。

（1）       测量池温度：将温度控制在说明书中所述的温度条件内。

（2）       环境温度：20℃以下，30℃以下。

（3）       相对湿度：65±20%

（4）       电源电压：额定电压

（5）       预备运转：按说明书的方法进行

（6）       校正：预备运转后，用BODs校正液按说明书中的方法进行校正。

7．3试验方法：试验方法如下所述。

（1）       重现性：使用说明书中记载的BODs校正液进行5次送液测量，取得平均值，用其与各测定值进行比较，求得与平均值的偏差。

（2）       响应时间：首先向测量池内送入缓冲液，在此状态下待微生物电极的输出电流稳定后，注入BODs校正液，记录输出电流值求得送液前后的输出电流值的差在达到*终值的90%时所用的时间（响应时间）。此时，如使用的是分批方式测定的测量仪即可按分批方式进行测定，BODs的使用量按规定的添加量使用。另外，如使用的仪器只能按连续方式进行进行测定，即按连续方式进行测定，测定中必须使用规定是的BODs校正液，按一定的流速进行送液。

（3）       电压变动的安全性：保持电源电压为额定电压，按照（2）的方法进行BODs校正液的送液，当指示值达到一定值（*终值）后，使电源电压在额定电压的±10%范围内变化。电压变动的同时，指示值也随之变化，此变化量与额定电压下的指示值的百分率，即为指示值的变动。

（4）       阻抗：用电流表测定测量仪在电器回路关闭的状态下，所有电源端子与外箱（接地端子）的阻抗是否为JIS C 1302中规定的直流500V。

（5）       耐电压：在回路关闭的状态下，向电源端子与外箱间加额定频率的交流电压1000V保持1分钟，确认有无异常。

8．表示：测量仪上以不易消失的方式记有以下事项。

（1）       机械名称及由制造者制定的形名或型号。

（2）       使用电源的种类及容量。

（3）       传送输出的种类（有必要时）。

（4）       制造厂家名称（或者注册商标）。

（5）       制造年月（或简略记号）或制造出厂号码。

9．使用说明：说明书中必须记载以下事项。

（1）有关使用方法的事项。

（1.1） 安装使用场所的选择及环境温度范围（厂家保证机械正常运转的环境规定）。

（1.2） 测量仪的构造、配线及配管的概略。

（1.3） 试剂的配制及保存方法，固定化微生物膜的保存方法（厂家提供全部试剂时，配制方法可以不进行介绍）以及固定化微生物膜在使用时需留意的卫生上的注意点。

（1.4） 关于测定的事项。

（a）       固定化微生物膜的活性化。

（b）       测定前的准备。

（c）       校正的方法和频度。

（d）       测定方法。

（e）       测定停止时的处理。

（f）        测量仪的线性范围，测定有害物质时的注意事项。

（2）有关保养的事项。

（a）       固定化微生物膜及微生物电极的更换标准频度。

（b）       固定化微生物膜的更换及微生物电极组装的方法和微生物电极的更换方法。

（c）       检出部分、配管的清扫及保养。

（d）       故障时的对策。

（3）使用上的注意事项：

（a）       日常点检的方法。

（b）       定期点检的方法。

附表1.     引用标准（略）

用微生物电极测定生物化学耗氧量（BODs）的测量仪（解说）

本解说是对于本体中规定的事宜及有关事宜的说明，不作为标准的一部分使用。

1．制定的方针：在对工厂排水和生活排水等水质进行管理时，从防止环境污染的立场上讲，迅速准确地掌握这些水的污浊状况是非常重要的。作为考察水污浊状况的指标之一是监测生物化学耗氧量（BODs）。BOD的测定方法已被广泛认可，在标准化（ JIS K 0102（工厂排水试验方法））中所采用的方法是在被测水中接种微生物进行5天的培养，求得在此期间的氧的消耗量的方法（以下称为五天法）。但是用五天法进行BOD测定时，不能进行迅速地水质管理。因此，出现了种种如何在短时间内迅速测定BOD的方法（以下称为短时法），这些方法主要是着重考虑如何在1小时左右的短时内测定由微生物降解反应所引起的氧的消耗量，所以其各种指标与五天法所使用的有所不同，一方面，不论是工厂排水还是生活排水中所含有机物在短时间内进行微生物降解反应的成分较多，因此迅速地对被测水质的污染状况进行判断、用短时法测定出的结果来推定五天沙土的结果，具有很大的必要性。但是，各种方法的数据指标结果有所不同，不能统一，所以给测定方法的研究、开发以及对各种被测水质进行测定时的测定方法的应用实验造成了若干混乱。因此，为了促进短时法的发展，已经到了选择在技术方面、利用方面比较先进的方法并必须对此方法进行标准化、系统化的时期。

近年来，随着生物传感器的显著进步，用于测量BOD的传感器（BOD传感器）在技术方面和利用方面取得的进展，也已经得到了广泛的认可。

日本通商产业省资源能源厅于昭和62年委托财团法人生物工业协会进行新燃料油的开发调查《利用生物工艺进行新燃料油的生产及有关应用技术的可能性调查（以农林产废充弃物及有机性废水为原料产生新燃料的系统的有关调查）》。在此调查过程中，生物工业协会设置了有关生物传感器的标准化调查研究委员会（委员长为：轻部征夫，当时工业大学教授）。进行BOD传感器的基础研究工作的同时，进行其实现标准化的实践调查，本项工作的总结性报告于昭和63年3月上交于通商产业省。

在这个报告中，指出了利用BOD传感器制成测量仪并使其标准化的可能性，并指出用传感器进行测量的方法具有便携性、迅速性及可重复使用性等优秀的特殊性能。并且提出要注意用此原理制成的测量仪具有在短时间内可监测有机物降解反应造成氧的消耗速度变化的特征。

根据上记的调查研究，工业技术院标准部在昭和63年度，委托财团法人生物工业协会进行制定工业标准草案的工作。协会在接受任务的同时，以下表所示的组成情况组成了“生物化学耗氧量（BOD）测量仪的工业标准新规草案委员会（委员长为：轻部征夫，东京大学教授）”，进行草案的制定和审批工作。

生物化学耗氧量（BOD）测量仪的工业标准新规草案委员会构成表（略）

2．  标准本身的解说：以下对审批时出现的问题及有必要说明的问题进行说明。

本标准*大的特点是使用了利用微生物电极法的原理制成的BOD测量仪，并且在测量仪中使用的微生物电极（BOD传感器）是使用单一的特定菌株的微生物构成的。在进行爱条的解说前，先对本标准采用的测量仪的特征进行了上述解说。

BOD是指在水中的有机物质被水中的微生物降解时引起的溶解氧的减少量。正如“测定的方针”项目中所说的，现在标准的试验方法（以下称标准法）是五天法。为了得到准确的测量数据必须经过五天的理由之一是，在五天左右的时间里，排水中的有机物质在进行氧化反应时，不会因硝化反应受到大的影响作用。但是，作为测定数据需五天时间这一点上，此方法不能迅速地对水质状况加以管理，所以作为各种缩短测定时间的其它方法（短时法）的提出是理所当然的。

在使用五天法进行BOD测定时，是由被测水中的微生物对有机物进行直接或分解后的摄取、产生异化、同化代谢时的氧化，维持代谢的氧化，由于微生物的增殖造成的氧化速度的加快，因原生动物在捕食微生物时形成食物链造成的氧化率的上升等极其复杂的过程后得出的结果。从进行水质管理观点看，测定时间要求在数小时内完成，但在此时间内发生上述所记的全部现象是非常困难的。在短时间内完成测定时，上记现象中的比较快地发生摄取、同化、异化代谢中的一部分过程的氧消耗量被测出。因此，用短时法测得的BOD值当然与五天法的结果有所不同。两者间的结果有比较一致的时候，也有没出的时候。例如被测水中含有高分子化合物时，短时法测得的值比五天法低。

即无论采取什么样的方法，也不可能使用短时法得到五天法完全相同的BOD值，所以应该将短时法测得的BOD值与五天法测得的BOD值区别考虑。但是，如果能得知短时法BOD值与五天法BOD值之间有无关系，如有关系，事先求得其之间的推算方法，那么就可以用短时法的测定值推算出五天法的测定值，根据短时法的试验报告得知，一般短时法值与五天法值的比率因被测水的不同而有所不同，但对同一种被测水而言，比率是比较一定的。在很多情况下，可以用短时法测定结果推算五天法BOD值。

如上所述，使用五天法对水质进行管理时既有其适用性，又同时存在着困难。为了弥补这一缺点，利用短时法对水质进行监测，并且提出了以推定五天法BOD值为目的的各种短时法。但是提出的短时法方案分为多种形式，各种方法的研究积累都不充足。在此状况下，需要对短时法进行整理，规定用特定的方法及标准。这样不但有益于使用者更简单地使用短时法，而且根据所积累的数据结果可促进今后短时法的进步。根据以上判断，可得出必须制定标准的短时法的结论。

作为所制定标准的对象，首先至少满足以下的标准。这些标准都是作为能够细致而具体地进行水质管理的必要的不可欠缺的细则。

（1）       在1小时内测得BOD值。

（2）       对微生物的管理及测定时的操作做到尽可能地简便。

（3）       对两种以上的办公室排水的试验结果进行比较，判断其具有一定程度的实际使用性。

（4）       必须是可将试验结果相互比较的方法。

作为满足标准1及标准2的*佳方法，选择了使用固定化微生物膜与氧电极组合而成的微生物电极的方法。作为微生物电极法所使用的测量仪的的实用性非常良好。使用此测量仪时，只需注入适当量的被测水，经过20分钟即可测得BOD值。作为可满足标准1的其它方法是沉淀大量被测水中的污泥，求得其氧的初期的消耗速度。但是使用这种方法时，在对使用的微生物进行管理、供给时需要劳动力，不能满足标准2的条件。在微生物电极法中，代替劳动力的是利用固定的膜中的微生物，在极容易地进行微生物管理方面取得了成功。

微生物电极法作为满足了标准2、3、4的方法，选择了利用特定的单一菌株的微生物的方法。五天法主要是利用被测水中沉淀污泥，但事实上也在使用微生物电极法方面进行了利用固定化活性污泥方面的种种研究。并且，以报告形式提出了在利用固定化活性污泥方法上，如使用单一菌株的微生物时，其测定结果与五天法的相关性较好的实例。但是，这个报告的数据只适用于单一的事务所排水。一般使用固定化的活性污泥时，微生物相随时间的变化而产生变化，因此应答也随时间发生变化，所以也出现了不能与五天法取得满意的相关性的问题。因此，在使用各种被测水的沉淀活性污泥时，其测定结果的相互比较非常困难，即使大量积累其自身的数据，也不能良好地完善其自身，在将来发展排队水管理方面存在着问题。对此，如使用单一菌株的微生物时，如选用适当的菌株，其应答（反应）性受时间的影响变化较好，另外，在各个测定结果的比较方面也比较容易。对于使用单一菌株微生物的的测定方法，一般被提出的疑问是，在五天法中使用多种微生物，与只使用单菌株微生物的原理相差是否太大这一点。但是，如上所述，不管使用什么微生物相，利用短时法测定时，在其测定时间范围内所发生的现象本身与五天法都不相同，基于认识到这一点，如短时法使用的微生物相与五天法相同时，其原理也应与五天法相同。因此，判断使用单一菌株微生物时，认为在原理上差异很大是不妥当的。即无论使用什么样的微生物相，短时法与五天法是不同的方法，用两种方法测得BOD值本身当然也是不同的。但是根据使用适当的条件可以得到较高的相关性的的想法是妥当的。在此，本标准要求测试结果能够相互比较（标准4），并且对使用时各个方面的操作简便性（标准2）都非常重视。因此对能够满足这些条件的使用单一菌株的微生物为基础的微生物电极法进行了相关的标准化。

即使是使用单一菌株的微生物，根据其种类及菌株的不同，其利用的适用性也有所不同。作为希望具有的性能有：同化广泛，即使在营养状态发生变化时也能保持稳定等。例如：营养不足时形成孢子的微生物不能被使在微生物电极上。一般情况下，微生物电极是被保存在不含有养分的水中或与缓冲液状态下。传感器利用过的微生物在此过程中形成孢子，当再次接触含有营养源的排水时，就不再会发生反应。BOD传感器使用的微生物必须是同化性广州、稳定性良好等基础出发的适用性强的微生物，并且必须通过充分的试验及实际使用证明的微生物。作为能满足上记标准3内容的，是一种酵母菌。因此，对于使用这个菌株构成的BOD传感器进行了标准化。

下面，对本标准的对象、使用BOD传感器构成BOD测量仪的理由进行简单的解说。在制定BOD传感器的标准化工作时，存在着多种选择对象。例如：将传感器本身作为对象考虑，或者将利用传感器的测定法作为对象考虑。包括BOD传感器在内的微生物电极，在测定时不单只是传感器本身被利用，而是以与维持其适当的测定条件的附加装置一起组成测量仪的形式被利用的。另外，根据测量仪的构造的不同，利用传感器的测定方法也有所变化，不能一律地进行标准化，因此可以判断将传感器本身或利用传感器的测定法作为对象进行标准化是不现实的。而另一方面，同样利用微生物传感器的测量仪，是以酵母电极法为基础、相应地利用葡萄糖传感器及 糖传感器的测量仪实际上都已根据各自的特点进行标准化。JIS K0701（葡萄糖测量仪）；JIS K 3601（乳糖测量仪）。在次，关此BOD传感器的标准化，也是以利用传感器的测量仪为对象进行的。

以下进行逐条的解说。

标准的名称

为了避免与水质污浊防止法所采用的五天法相混淆，再有，如上所述，鉴于五天法与本标准的方法所测定的是不同的对象，本标准的测量仪测定的BOD为“利用微生物电极测定生物化学耗氧量（BODS）”所以将本标准的名称定为：“利用微生物电极测定生物化学耗氧量（BODS）的测量仪”。

1适用范围：

本标准的方法，即利用酵母的固定化膜与氧电极组合而成的微生物电极的方法，其测量对象是试样中存在的有机物在短时间内的同化反应。与本标准的方法同样的短时法在测量时，在不溶性成分可溶化发生前，测定已经终了，所以其测定对象当然是不溶性成分以外的成分。对所适用的被测水的范围、种类进行系统的定义工作是非常困难的，但报告中列举了适用的几种工厂排水的实例。

2.名词的定义：

本标准使用的微生物是财团法人研究所提供的菌株（关连特许公告番号 昭61—7258）。使微生物固定化的方法是：将微生物密封在多孔性的高分子膜内。

3.微生物电极的构成及测定方法：

3．2氧电极

（1）       隔膜形极谱式氧电极：

此微生物电极所使用的电极的检出方式是在固定化微生物与有机物发生同化反应、伴随着氧的消耗（固定化微生物的呼吸活性增大）时，通过隔膜极谱式氧电极的电流的减小进行检出的。隔膜形极谱式氧电极的测量原理是：通过插入用氧透过性膜与外部的割断的内部电解液（通常为3mol/L左右浓度的氯化钾水溶液）中的阴阳电极间，阴极还原氧时在充分的电压下其电流的变化进行测定的。

（2）       隔膜形原电池式氧电极：