GB 4789.4—2010沙门氏菌检验

本标准代替 GB/T 4789.4-2008《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》。 本标准与 GB/T 4789.4-2008 相比，主要变化如下：

　　——修改了标准的中英文名称; ——修改了标准的范围; ——修改了培养基和试剂; ——修改了设备和材料; ——修改了附录 A。

　　本标准的附录 A、附录 B 为规范性附录。 本标准所代替的历次版本发布情况为：

　　——GB 4789.4-84、GB 4789.4-1994、GB/T 4789.4-2003、GB/T 4789.4-2008。

　　I

　　GB 4789.4—2010

　　食品安全国家标准

　　食品微生物学检验 沙门氏菌检验

　　1 范围

　　本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。 本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。

　　2 设备和材料

　　除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

　　2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。

　　2.2 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。

　　2.3 均质器。

　　2.4 振荡器。

　　2.5 电子天平：感量 0.1 g。

　　2.6 无菌锥形瓶:容量 500 mL，250 mL。

　　2.7 无菌吸管：1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。

　　2.8 无菌培养皿：直径 90 mm。

　　2.9 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。

　　2.10 无菌毛细管。

　　2.11 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。

　　2.12 全自动微生物生化鉴定系统。

　　3 培养基和试剂

　　3.1 缓冲蛋白胨水(BPW)： 见附录 A 中 A.1。

　　3.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液：见附录 A 中 A.2。

　　3.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液：见附录 A 中 A.3。

　　3.4 亚硫酸铋(BS)琼脂：见附录 A 中 A.4。

　　3.5 HE 琼脂：见附录 A 中 A.5。

　　3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂：见附录 A 中 A.6。

　　1

　　GB 4789.4—2010

　　3.7 沙门氏菌属显色培养基。

　　3.8 三糖铁(TSI)琼脂：见附录 A 中 A.7。

　　3.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A 中 A.8。

　　3.10 尿素琼脂(pH 7.2)：见附录 A 中 A.9。

　　3.11 氰化钾 (KCN) 培养基：见附录 A 中 A.10。

　　3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A.11。

　　3.13 糖发酵管：见附录 A 中 A.12。

　　3.14 邻硝基酚 β-D 半乳糖苷(ONPG)培养基：见附录 A 中 A.13。

　　3.15 半固体琼脂：见附录 A 中 A.14。

　　3.16 丙二酸钠培养基：见附录 A 中 A.15。

　　3.17 沙门氏菌 O 和 H 诊断血清。

　　3.18 生化鉴定试剂盒。

　　2

　　GB 4789.4—2010

　　4 检验程序

　　沙门氏菌检验程序见图 1。

　　检样

　　25 g(mL)样品+225 mLBPW

　　36 ℃±1 ℃，8 h～18 h

　　1 mL+TTB 10 mL 1 mL+SC 10 mL

　　42 ℃±1 ℃，18 h～24 h 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h

　　BS XLD(或 HE、显色培养基)

　　36 ℃±1 ℃，40 h～48 h 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h

　　挑取可疑菌落

　　TSI，赖氨酸，NA， 靛基质， 尿素 (pH 7.2)，KCN

　　生化鉴定试剂盒或全 H2S+ 靛 基 质 - H2S+ 靛 基 质 + H2S- 靛基质- 尿 反应结果与左

　　自动微生物生化鉴定 尿素-KCN- 尿素- KCN- 素-KCN- 侧描述不符

　　系统+ 赖氨酸 + 赖氨酸+ 赖氨酸+/-

　　甘露醇+、山梨醇+ ONPG-

　　沙门氏菌，血清学试验 非沙门氏菌

　　报告

　　图 1 沙门氏菌检验程序

　　5 操作步骤

　　5.1 前增菌

　　称取 25 g(mL)样品放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中，以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质

　　1 min～2 min，或置于盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。若样 品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定 pH 值，用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.8±0.2。

　　3

　　GB 4789.4—2010

　　无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 36 ℃±1 ℃培养 8 h～ 18h。

　　如为冷冻产品,应在 45 ℃以下不超过 15 min,或 2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻。

　　5.2 增菌

　　轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于 42 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。

　　5.3 分离

　　分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板(或 HE 琼脂 平板或沙门氏菌属显色培养基平板)。于 36 ℃±1 ℃分别培养 18 h～24 h (XLD 琼脂平板、HE 琼脂 平板、沙门氏菌属显色培养基平板) 或 40 h～48 h (BS 琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落, 各个平板上的菌落特征见表 1。

　　表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

　　选择性琼脂平板沙门氏菌

　　BS 琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色;有些

　　菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。

　　HE 琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色，中心黑色或

　　几乎全黑色。

　　XLD 琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或

　　呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。

　　沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。

　　5.4 生化试验

　　5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线， 再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 ℃±1 ℃ 培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属 的反应结果见表 2。

　　表 2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

　　三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断

　　斜面底层产气硫化氢

　　KA+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属

　　KA+(-)+(-)-可疑沙门氏菌属

　　AA+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属

　　AA+/-+/--非沙门氏菌

　　KK+/-+/-+/-非沙门氏菌

　　注：K：产碱，A：产酸;+：阳性，-：阴性;+(-)：多数阳性，少数阴性;+/-：阳性或阴性。

　　5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 (供做靛基质试 验)、尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑 取可疑菌落接种。于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h，按表 3 判定结果。将已挑菌 落的平板储存于 2 ℃～5 ℃或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。

　　4

　　GB 4789.4—2010

　　表 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

　　反应序号硫化氢靛基质pH 7.2 尿素氰化钾赖氨酸脱羧酶

　　(H2S) (KCN)

　　A1+ - --+

　　A2+ + --+

　　A3- - --+/-

　　注：+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性。

　　5.4.2.1 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异常，按表 4 可判定为沙门氏菌。 如有 2 项异常为非沙门氏菌。

　　表 4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

　　pH 7.2 尿素氰化钾(KCN)赖氨酸判 定 结 果

　　脱羧酶

　　---甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)

　　-++沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)

　　+-+沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果)

　　注：+表示阳性;+表示阴性。

　　5.4.2.2 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳 性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

　　5.4.2.3 反应序号 A3：补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒 沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

　　5.4.2.4 必要时按表 5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。

　　表 5 沙门氏菌属各生化群的鉴别

　　项 目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ

　　卫矛醇++--+-

　　山梨醇+++++-

　　水杨苷---+--

　　ONPG--+-+-

　　丙二酸盐-++---

　　KCN---++-

　　注：+表示阳性; -表示阴性。

　　5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 5.4.1 的初步判断结果，从营 养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动 微生物生化鉴定系统进行鉴定。

　　5.5 血清学鉴定

　　5.5.1 抗原的准备

　　一般采用 1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

　　O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 (如 2%～3%) 培养基上再检查;如果是由于 Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰

　　5

　　GB 4789.4—2010

　　上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在 0.55%～0.65%半固体琼脂平板的中央，俟菌落 蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有 0.3%～0.4%半固体琼脂的小玻管 1 次～2 次，自远端取菌培养后再检查。

　　5.5.2 多价菌体抗原(O)鉴定

　　在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上 部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体(O)抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对 照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对 着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

　　5.5.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定

　　同 5.5.2。

　　5.5.4 血清学分型(选做项目)

　　5.5.4.1 O 抗原的鉴定

　　用 A～F 多价 O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形 菌株，不能分型。

　　被 A～F 多价 O 血清凝集者，依次用 O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2 和 O11 因子血清做凝集 试验。根据试验结果，判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株，再用 O10、O15、O34、O19 单因 子血清做凝集试验，判定 E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个 O 抗原成分的*后确定均应根据 O 单因 子血清的检查结果，没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对。

　　不被 A～F 多价 O 血清凝集者，先用 9 种多价 O 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种 血清所包括的 O 群血清逐一检查，以确定 O 群。每种多价 O 血清所包括的 O 因子如下：

　　O 多价 1 A，B，C，D，E，F，群 (并包括 6,14 群)

　　O 多价 2 13，16，17，18，21 群 O 多价 3 28，30，35，38，39 群 O 多价 4 40，41，42，43 群

　　O 多价 5 44，45，47，48 群 O 多价 6 50，51，52，53 群 O 多价 7 55，56，57，58 群 O 多价 8 59，60，61，62 群 O 多价 9 63，65，66，67 群

　　5.5.4.2 H 抗原的鉴定

　　属于 A～F 各 O 群的常见菌型，依次用表 6 所述 H 因子血清检查第 1 相和第 2 相的 H 抗原。

　　表 6 A～F 群常见菌型 H 抗原表

　　O 群第 1 相第 2 相

　　Aa无

　　Bg,f,s无

　　Bi,b,d2

　　C1k,v,r,c5,z15

　　C2b,d,r2,5

　　D( 不产气的)d无

　　D(产气的)g,m,p,q无

　　E1h,v6,w,x

　　E4g,s,t无

　　E4i

　　6

　　GB 4789.4—2010

　　不常见的菌型，先用 8 种多价 H 血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种 血清所包括的各种 H 因子血清逐一检查，以第 1 相和第 2 项的 H 抗原。8 种多价 H 血清所包括的 H 因子如下：

　　H 多价 1 a，b，c，d，i

　　H 多价 2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51 H 多价 3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40

　　H 多价 4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6

　　H 多价 5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38 H 多价 6 z39，z41，z42，z44

　　H 多价 7 z52，z53，z54，z55

　　H 多价 8 z56，z57，z60，z61，z62

　　每一个 H 抗原成分的*后确定均应根据 H 单因子血清的检查结果，没有 H 单因子血清的要用两 个 H 复合因子血清进行核对。

　　检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原而未检出第 1 相 H 抗原的,可 在琼脂斜面上移种 1～2 代后再检查。如仍只检出一个相的 H 抗原，要用位相变异的方法检查其另一 个相。单相菌不必做位相变异检查。

　　位相变异试验方法如下：

　　小玻管法：将半固体管(每管约 1 mL～2 mL) 在酒精灯上溶化并冷至 50 ℃，取已知相的 H 因子血清 0.05 mL～0.1 mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试 验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁 放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端 挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细 菌的动力不能抑制。一般按原血清 1：200～1：800 的量加入。

　　小倒管法：将两端开口的小玻管 (下端开口要留一个缺口，不要平齐) 放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至 50 ℃，挑取因子 血清 1 环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管 中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或 转种 1%软琼脂斜面，于 37 ℃培养后再做凝集试验。

　　简易平板法：将 0.35%～0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清 1 环，滴在半固体 平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓 延生长的菌苔边缘取菌检查。

　　5.5.4.3 Vi 抗原的鉴定

　　用 Vi 因子血清检查。已知具有 Vi 抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林 沙门氏菌。

　　5.5.4.4 菌型的判定

　　根据血清学分型鉴定的结果，按照附录 B 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。

　　6 结果与报告

　　综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。

　　7

　　GB 4789.4—2010

　　附录A

　　(规范性附录)

　　培养基和试剂

　　A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)

　　A.1.1 成分

　　蛋白胨10.0 g

　　氯化钠5.0 g

　　磷酸氢二钠(含 12 个结晶水)9.0 g

　　磷酸二氢钾1.5 g

　　蒸馏水1 000 mL

　　pH 7.2±0.2

　　A.1.2 制法

　　将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，高压灭菌 121 ℃，15 min。

　　A.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液

　　A.2.1 基础液

　　蛋白胨10.0 g

　　牛肉膏5.0 g

　　氯化钠3.0 g

　　碳酸钙45.0 g

　　蒸馏水1 000 mL

　　pH 7.0±0.2

　　除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节 pH，高压灭菌 121 ℃，

　　20 min。

　　A.2.2硫代硫酸钠溶液

　　硫代硫酸钠(含 5 个结晶水)50.0 g

　　蒸馏水加至 100 mL

　　高压灭菌 121 ℃，20 min。

　　A.2.3碘溶液

　　碘 片20.0 g

　　碘化钾25.0 g

　　蒸馏水加至 100 mL

　　将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸 馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。

　　A.2.40.5%煌绿水溶液

　　煌绿0.5 g

　　蒸馏水100 mL

　　溶解后，存放暗处，不少于 1d，使其自然灭菌。

　　A.2.5牛胆盐溶液

　　牛胆盐10.0 g

　　8

　　GB 4789.4—2010

　　蒸馏水100 mL

　　加热煮沸至完全溶解，高压灭菌 121 ℃，20 min。

　　A.2.6 制法

　　基础液900 mL

　　硫代硫酸钠溶液100 mL

　　碘溶液20.0 mL

　　煌绿水溶液2.0 mL

　　牛胆盐溶液50.0 mL

　　临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另

　　一种成分。

　　A.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液

　　A.3.1 成分

　　蛋白胨5.0 g

　　乳糖4.0 g

　　磷酸氢二钠10.0 g

　　亚硒酸氢钠4.0 g

　　L-胱氨酸0.01 g

　　蒸馏水1 000 mL

　　pH 7.0±0.2

　　A.3.2 制法

　　除亚硒酸氢钠和 L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至 55 ℃以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和 1 g/L L-胱氨酸溶液 10 mL(称取 0.1 g L-胱氨酸，加 1 mol/L 氢氧化钠溶液 15 mL， 使溶解，再加无菌蒸馏水至 100 mL 即成，如为 DL-胱氨酸，用量应加倍)。摇匀，调节 pH。

　　A.4 亚硫酸铋(BS)琼脂

　　A.4.1成分

　　蛋白胨10.0 g

　　牛肉膏5.0 g

　　葡萄糖5.0 g

　　硫酸亚铁0.3 g

　　磷酸氢二钠4.0 g

　　煌 绿0.025 g 或 5.0g/L 水溶液 5.0mL

　　柠檬酸铋铵2.0 g

　　亚硫酸钠6.0 g

　　琼 脂18.0 g～20 g

　　蒸馏水1 000 mL

　　pH 7.5±0.2

　　A.4.2制法

　　将前三种成分加入 300 mL 蒸馏水(制作基础液)，硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中，琼脂加入 600 mL 蒸 馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至 80 ℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入 基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节 pH，随即倾入琼脂 液中，混合均匀，冷至 50 ℃～55 ℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。

　　9

　　GB 4789.4—2010

　　注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过 48 h 会

　　降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。

　　A.5 HE 琼脂(Hektoen Enteric Agar)

　　A.5.1成分

　　蛋白胨12.0 g

　　牛肉膏3.0 g

　　乳糖12.0 g

　　蔗糖12.0 g

　　水杨素2 .0 g

　　胆盐20.0 g

　　氯化钠5.0 g

　　琼脂18.0 g～20.0 g

　　蒸馏水1 000 mL

　　0.4%溴麝香草酚蓝溶液16.0 mL

　　Andrade 指示剂20.0 mL

　　甲液20.0 mL

　　乙液20.0 mL

　　pH 7.5±0.2

　　A.5.2制法

　　将前面七种成分溶解于 400 mL 蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于 600 mL 蒸馏水内。然后分别 搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节 pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至 50 ℃～55 ℃倾注平皿。

　　注:①本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。

　　②甲液的配制

　　硫代硫酸钠34.0 g

　　柠檬酸铁铵4.0 g

　　蒸馏水100 mL

　　③乙液的配制

　　去氧胆酸钠10.0 g

　　蒸馏水100 mL

　　④ Andrade 指示剂

　　酸性复红0.5 g

　　1mol/L 氢氧化钠溶液16.0 mL

　　蒸馏水100 mL

　　将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液 1 mL～2 mL。

　　A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂

　　A.6.1 成分

　　酵母膏3.0 g

　　L-赖氨酸5.0 g

　　木糖3.75 g

　　乳糖7.5 g

　　10

　　GB 4789.4—2010

　　蔗糖7.5 g

　　去氧胆酸钠2.5 g

　　柠檬酸铁铵0.8 g

　　硫代硫酸钠6.8 g

　　氯化钠5.0 g

　　琼脂15.0 g

　　酚红0.08 g

　　蒸馏水1 000 mL

　　pH 7.4±0.2

　　A.6.2 制法

　　除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。

　　将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 50 ℃～55 ℃倾注平皿。 注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。

　　本培养基宜于当天制备，第二天使用。

　　A.7 三糖铁(TSI)琼脂

　　A.7.1 成分

　　蛋白胨 20.0 g

　　牛肉膏 5.0 g

　　乳 糖 10.0 g

　　蔗 糖 10.0 g

　　葡萄糖 1.0 g

　　硫酸亚铁铵(含6 个结晶水)0.2 g

　　酚 红0.025 g 或 5.0 g/L 溶液 5.0 mL

　　氯化钠 5.0 g

　　硫代硫酸钠 0.2 g

　　琼 脂 12.0 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　pH 7.4±0.2

　　A.7.2 制法

　　除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。

　　将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约 2 mL～4 mL，高压灭菌 121 ℃ 10 min 或 115 ℃ 15 min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。

　　A.8蛋白胨水、靛基质试剂

　　A.8.1蛋白胨水

　　蛋白胨(或胰蛋白胨)20.0 g

　　氯化钠5.0 g

　　蒸馏水1 000 mL

　　pH 7.4±0.2

　　将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH，分装小试管,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　A.8.2 靛基质试剂

　　11

　　GB 4789.4—2010

　　A.8.2.1 柯凡克试剂：将 5 g 对二甲氨基甲醛溶解于 75 mL 戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。 A.8.2.2 欧-波试剂：将 1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸 20 mL。

　　A.8.3 试验方法

　　挑取小量培养物接种,在 36 ℃±1 ℃培养 1 d～2 d，必要时可培养 4 d～5 d。加入柯凡克试剂约 0.5 mL，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约 0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养 液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

　　注：蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。

　　A.9尿素琼脂(pH 7.2)

　　A.9.1成分

　　蛋白胨1.0 g

　　氯化钠5.0 g

　　葡萄糖1.0 g

　　磷酸二氢钾2.0 g

　　0.4%酚 红3.0 mL

　　琼 脂20.0 g

　　蒸馏水1 000 mL

　　20%尿素溶液100 mL

　　pH7.2±0.2

　　A.9.2制法

　　除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加 入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。

　　将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂后分装，121 ℃高压灭菌 15 min。冷至 50 ℃～55 ℃, 加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的*终浓度为 2%。分装于无菌试管内，放成斜面备用。

　　A.9.3 试验方法

　　挑取琼脂培养物接种,在 36 ℃±1 ℃培养 24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变 为红色。

　　A.10氰化钾 (KCN) 培养基

　　A.10.1成分

　　蛋白胨10.0 g

　　氯化钠5.0 g

　　磷酸二氢钾0.225 g

　　磷酸氢二钠5.64 g

　　蒸馏水1 000 mL

　　0.5%氰化钾20.0 mL

　　A.10.2制法

　　将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后 121 ℃高压灭菌 15 min。放在冰箱内使其充分冷却。每 100 mL 培养基加入 0.5%氰化钾溶液 2.0 mL(*后浓度为 1:10 000)，分装于无菌 试管内,每管约 4 mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在 4 ℃冰箱内,至少可保存两个月。同时，将不加氰化 钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。

　　A.10.3 试验方法

　　将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取 1 环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另

　　12

　　GB 4789.4—2010

　　挑取 1 环接种于对照培养基。在 36 ℃±1 ℃培养 1 d～2 d，观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑 制)，经 2 d 细菌不生长为阴性(抑制)。

　　注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要 原因是封口不严,氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试

　　验时对每一环节都要特别注意。

　　A.11赖氨酸脱羧酶试验培养基

　　A.11.1成分

　　蛋白胨5.0 g

　　酵母浸膏3.0 g

　　葡萄糖1.0 g

　　蒸馏水1 000 mL

　　1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0 mL

　　L-赖氨酸或 DL-赖氨酸 0.5 g/100 mL 或1.0 g/100 mL pH 6.8±0.2

　　A.11.2 制法

　　除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶 100 mL，分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按 0.5%加入， DL-赖氨酸按 1%加入。调节 pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管 0.5 mL， 上面滴加一层液体石蜡，115 ℃高压灭菌 10 min。

　　A.11.3 试验方法

　　从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者 由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应 为黄色。

　　A.12 糖发酵管

　　A.12.1成分

　　牛肉膏5.0 g

　　蛋白胨10.0 g

　　氯化钠3.0 g

　　磷酸氢二钠(含 12 个结晶水)2.0 g

　　0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0 mL

　　蒸馏水1 000 mL

　　pH 7.4±0.2

　　A.12.2制法

　　A.12.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节 pH。按 0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小

　　管的小试管内，121 ℃高压灭菌 15 min。

　　A.12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶 100 mL，121 ℃高压灭菌 15 min。另将 各种糖类分别配好 10%溶液，同时高压灭菌。将 5 mL 糖溶液加入于 100 mL 培养基内，以无菌操作 分装小试管。

　　注：蔗糖不纯,加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

　　A.12.3 试验方法:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于 36 ℃±1 ℃培养,一般 2 d～3 d。迟缓反应 需观察 14 d～30 d。

　　A.13 ONPG 培养基

　　13

　　GB 4789.4—2010

　　A.13.1 成分

　　邻硝基酚 β-D 半乳糖苷(ONPG)60.0 mg

　　(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)

　　0.01mol/L 磷酸钠缓冲液(pH7.5)10.0 mL

　　1%蛋白胨水(pH7.5)30.0 mL

　　A.13.2 制法

　　将 ONPG 溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管 0.5 mL， 用橡皮塞塞紧。

　　A.13.3 试验方法

　　自琼脂斜面上挑取培养物 1 满环接种于 36 ℃±1 ℃培养 1 h～3 h 和 24 h 观察结果。如果 β-半乳糖苷酶产生，则于 1 h～3 h 变黄色，如无此酶则 24 h 不变色。

　　A.14半固体琼脂

　　A.14.1成分

　　牛肉膏0.3 g

　　蛋白胨1.0 g

　　氯化钠0.5 g

　　琼脂0.35g～0.4 g

　　蒸馏水100 mL

　　pH 7.4±0.2

　　A.14.2制法

　　按以上成分配好,煮沸溶解,调节 pH。分装小试管。121 ℃高压灭菌 15 min。直立凝固备用。 注:供动力观察、菌种保存、H 抗原位相变异试验等用。

　　A.15丙二酸钠培养基

　　A.15.1成分

　　酵母浸膏1.0 g

　　硫酸铵2.0 g

　　磷酸氢二钾0.6 g

　　磷酸二氢钾0.4 g

　　氯化钠2.0 g

　　丙二酸钠3.0 g

　　0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0 mL

　　蒸馏水1 000 mL

　　pH 6.8±0.2

　　A.15.2制法

　　除指示剂以外的成分溶解于水，调节 pH，再加入指示剂，分装试管，121 ℃高压灭菌 15 min。

　　A.15.3 试验方法

　　用新鲜的琼脂培养物接种，于36 ℃±1 ℃培养48 h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。

　附录 B (规范性附录)